初始事件集中于佛罗伦萨与托斯卡纳地区，包含艾吉奥父亲与兄弟被陷害处决的悲剧、初期复仇目标的清除，以及逃亡至叔叔马里奥的蒙特里久尼庄园接受基础刺客训练。此阶段奠定了艾吉奥的战斗技能与对刺客信条的最初认知，约占据前4个事件。随后剧情重心转向威尼斯，艾吉奥联合当地盗贼、佣兵及交际花势力，渗透贵族阶层并破坏圣殿骑士的金融与政治网络，包括刺杀掌控威尼斯的圣殿骑士首领巴尔巴里戈。这一阶段横跨5个事件，逐步提升刺杀难度并引入更复杂的城市环境互动。
除主线事件外，游戏包含多个强化叙事深度的支线体系。收集30页阿泰尔密函可解锁终极护甲，密函内容涉及袖剑改良技术（如双袖剑、毒刃设计）及刺客信条哲学。100根羽毛收集任务则关联家族情感线，集齐后可触发艾吉奥母亲恢复情感反应的隐藏叙事。16个真相谜题需通过环境解谜与符号分析逐步揭露第一文明遗留的影像信息，补充现代剧情中戴斯蒙德对抗圣殿骑士的关键线索。
